2015版藥典-關于無菌檢查

2015版中國藥典--無菌檢測風險控制

無菌檢測的風險

假陽性：結果呈陽性，但污染不是產品所帶來的，而是其他方面，比如測試環境、方法、人員、操作等方面所帶來的污染。這種結果帶來的后果往往是企業花費大量的人力、物力和財力去進行長時間的調查，調查后卻找不到污染的根本原因，整批產品遭到報廢，并且法規禁止不以發現造成污染的根本原因為目的而只是重復測試的行為。

假陰性：結果呈陰性，但產品本身是存在微生物污染的，是由于微生物受到抑制或傷害沒有恢復出來才沒有生長。這種情況下，廠家會釋放產品，導致的后果有可能是，給藥后，微生物在合適的環境下大量增殖，病人遭受嚴重的傷害甚至危害到患者的生命。而企業則會面臨產品召回，品牌受損甚至工廠關閉風險。

無菌檢測環境因素

關于環境因素，主要是防止在試驗過程中的外來污染對于檢測過程的影響，防止假陽性的出現。尤其是針對于直接接種法和開放式薄膜過濾法的無菌檢測方法，外部環境的污染問題就成為無菌試驗假陽性的zui大可能。因此目前封閉式薄膜過濾法應用的越來越多。即便如此，外部環境的影響仍然對于樣品檢測是非常大的風險。目前對于環境控制的方法主要有兩個：B級下的局部*（萬級下的局部百級——2010版中國藥典）操作區域，或者隔離器中進行無菌操作。如果操作正確的話，兩種方式均能夠給我們的實驗室實現“近似”無菌的操作環境。

潔凈室中進行無菌檢測

對于B級下的*（國內通常是萬級下的百級）操作區域，通常是由層流臺來實現的，無論是垂直層流還是水平層流都能夠滿足我們的無菌檢驗需求。但是從工作原理上看，生物安全柜并不適合進行無菌試驗。應該定期對于層流臺進行檢測，塵埃粒子、風速、沉降菌、浮游菌等關鍵技術指標以保證該系統處于正常的工作狀態之中。對于萬級設施，應該將其等同視為生產區潔凈室進行控制，給局部百級一個較好的外部環繞環境，能夠更好地保證局部百級的運行。

在實驗過程中，無菌的保持也非常重要，特別是防止交叉污染，人員的操作和物品的位置移動都會造成這樣的情況。這就對人員的要求非常高，特別是對于“無菌意識”的提高，通常是zui容易講但是也zui難的技能和意識。整個檢測過程中一定要注意幾個原則：

1．物品可以從潔凈的“別”到“低級別”轉移，但是不可以從“低級別”到“別”轉移。進入潔凈室的人員必須經過無菌穿衣驗證，只有有資質的人員才可以進入潔凈室。

2．手作為交叉污染的媒介，應該及時定期對手套使用消毒劑進行清潔，如果有微生物污染風險較高的操作，應該及時對手套和無菌衣進行更換。

3．所有需要進入實驗操作區域的物品必須在經過適當處理后才進行操作。

4．試驗過程中一定要注意人的操作對于氣流和待試驗物品的污染。所有物品的去污染化，主要指的是物品的滅菌處理和轉移方式。對于可以進行高溫高壓進行過度滅菌的物品，應盡量采取使用這種方式（如果有雙門消毒鍋可以直接從無菌室將滅菌完畢的產品取出，如果沒有雙門消毒鍋，則需要將滅完菌的物品再次通過傳遞窗傳入潔凈室），如果該物品無法進行高溫高壓過度滅菌，則盡量通過浸泡的方式對表面的微生物進行去污染處理（如西林瓶裝的樣品和添加劑等），如果無法進行浸泡，則應該全面地進行消毒劑的噴灑和擦拭進行外表面的清潔。對于傳入傳遞窗的物品的外包裝，應盡量選用玻璃或者不銹鋼這一類的材質，盡量減少選用軟袋類的材質（軟袋類材質帶有大量的褶皺，很難對所有的外表面進行清潔）。

隔離器中進行無菌檢測

對于隔離器，它能夠提供一個相對較好的操作環境，由于相對封閉的腔體，加上所有的空氣進出均通過過濾裝置，所有物品進出必須經過相應的熏蒸。不同于層流臺，它對于外部環境也沒有那么高的要求，對于人員也不需要像潔凈室那樣嚴格的控制。但是它所達到的無菌環境的能力要更強于層流臺。當然，在隔離器中進行無菌檢測需要實驗人員對無菌實驗有更好的計劃性，例如每次實驗前需要有一個實驗物品的清單，防止在實驗過程中發現有物品的遺漏。而隔離器本身也需要有完整的滅菌記錄，需要定期的維護保養和驗證試驗。

潔凈室/隔離器環境監控

單向流空氣區、工作臺面及環境應定期按《醫藥工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔凈度確認。隔離系統應定期按相關的要求進行驗證，其內部環境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗還需對試驗環境進行監控。

檢測對象：人員，空氣，設備

檢測方法：浮游菌、沉降菌、表面微生物、塵埃粒子

無菌檢測方法因素

當進行產品無菌檢查法時，應進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于該產品的無菌檢查。若檢驗程序或產品發生變化可能影響檢驗結果時，應重新進行方法適用性試驗。對于無菌檢測的方法設計應考慮到：過濾性；化學兼容性，膜的兼容性；沖洗液類型及體積；潛在抑制問題.

無菌檢查是根據是否有微生物在液體培養基中生長來進行判斷的。培養14天后，觀察培養基有否變濁。

無菌檢測方法包括薄膜過濾法（開放式無菌檢查法及封閉式無菌檢查法）和直接接種法。

對于直接接種法，藥典中有描述：取規定量供試品分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基的容器中。除另有規定外，每個容器中培養基的用量應符合接種的供試品體積不得大于培養基體積的10%。實踐中，有兩種情況會選擇直接接種法，一種情況是供試品不可過濾或經過處理后也很難過濾，從而不能應用薄膜過濾法，還有一種情況是該品種項中要求用直接接種法來進行無菌檢查。除此之外都應選擇薄膜過濾法。

直接接種法的主要優點是適用于不可過濾的樣品；有些醫療器械的無菌檢查用直接接種法會比較方便，只需將其浸沒在培養基中即可。缺點是其屬于開放式的操作，容器的滅菌處理，打開容器，樣品打開包裝，接種等方面樣品、容器、培養基都與外界環境有直接接觸。風險包括會有污染的風險，造成假陽性的結果；藥品中或多或少都有一些抑菌的成分，如果用薄膜過濾法，那么通過濾膜的過濾作用加上后續的沖洗步驟，可以盡可能的把這些成分沖洗掉，這樣截留在膜片上的微生物就能得到有效的恢復，而直接接種法做不到這一點；微生物得不到有效的恢復，造成假陰性的結果，樣品直接放在裝有培養基的試管或容器中，會對實驗結果的觀察造成一定的影響。因此，往往需要后續的再轉接環節；觀察不到長菌的情況，造成假陰性的結果。另外，從操作性上直接接種法也有很大的局限性，通常里面接種的供試品體積不得超過總體積的10%，那簡單想一下，如果供試品體積比較大，再加上檢驗數量有一定的要求，那么需要用大量培養基來進行培養。所以通常來說，樣品體積超過100ml就不能使用直接接種法。從上面的分析可以看出，使用直接接種法有很大的局限性。所以藥典中規定只要供試品性狀允許，應采用薄膜過濾法。

封閉式無菌檢查方法設計合理，對供試液，沖洗液和培養基的操作全部都是在封閉的環境中進行，在結果的可靠性和可重復性上無疑做得更好，實驗結果出現假陽性和假陰性的幾率也低得多，而開放式的方法相對操作風險大，所以藥典中規定，薄膜過濾法應優先采用封閉式。

無菌檢測設備和實驗用品因素

和在普通微生物實驗室用到的試驗用品有所不同，在選擇適當的試驗物品的時候需要考慮到無菌室的特殊性：不可以影響無菌試驗的效果，也不可以對實驗室區域的環境造成任何可能的風險。試驗用品的材質必須易于清潔而不會脫落顆粒，特別是會接觸消毒劑的物品，如剪刀、鑷子和盛放消毒劑的容器，不能夠被腐蝕。當然，對于實驗用品外部材料的選擇應該盡量避免使用塑料軟袋，物品的滅菌袋子可以選用雙層無紡布袋子或者一次性滅菌袋。無菌試驗的時候還需要考慮的一個重點就是封閉式無菌檢測套筒，許多實驗人員也許知道怎么去選擇培養基，但是很多人并不了解封閉式無菌檢測套筒的工作原理和基本要求：

1．濾膜的完整性：濾膜的完整性需要從兩個方面進行考慮，一個是濾膜本身的完整性，一個是濾膜在裝配在塑料濾杯后的完整性。前者指的是濾膜表面是否具有不同于標示孔徑的微孔的缺陷，主要可以通過對濾膜本身進行起泡點試驗來得出zui大孔徑的數值，如果得出的起泡點試驗數據大于或者小于標稱數值，那么說明該濾膜本身的孔徑是不符合要求的，過大的孔徑會造成微生物的漏過，過小的孔徑會造成微生物在進行過濾的時候壓力過大，造成微生物的損傷，這兩種情況都會造成假陰性的結果；后者的情況比較復雜，主要是由于供應商的生產工藝不良造成的，主要表現是濾膜未能裝配緊固，造成濾膜和濾杯之間會發生存在空隙，液體在進行過濾的時候會造成樣品未能被濾膜截留而從空隙處流入下游。由于微生物未能夠被濾膜截留，像這種情況就會造成無菌試驗的假陰性。

2．呼吸器的完整性：類似于濾膜的完整性，也必須考慮呼吸器內濾膜的完整性和濾膜裝配到呼吸器內后的完整性。不同的是，呼吸器的作用是用于過濾進出無菌檢驗套筒的氣體的，它使用的是0.22μm的疏水性濾膜，它的檢驗是使用擴散流檢測法來證明它的孔徑。如果呼吸器的孔徑大于0.22μm，或者裝配時發生的空隙造成的完整性不佳，會使得呼吸器失去對空氣過濾除菌的效果，從而使整個實驗過程暴露在試驗環境中，將實驗發生假陽性的風險大大提高。

3．濾膜的流速測試：如果說濾膜的完整性測試證明了濾膜的zui大孔徑，但是這一數值不能夠表征過濾的效果，那么還需要對濾膜的平均孔徑和開孔率的平均效果作一次評估，這個時候就必須在標準溫度下使用純化水進行流速的測試，來保證濾膜的平均孔徑和開孔率受控（不會出現濾膜孔徑過小和開孔率不夠導致過濾壓力過大而產生的假陰性）。

4．濾膜的截留率試驗：同濾膜的流速測試相對應，還需要了解濾膜的zui小孔徑的效果會不會過大而影響截留微生物的效率。

5．整套無菌檢驗套筒的完整性：在整套套筒裝配完成之后，還需要對于整套產品進行完整性測試，證明所有的粘合、超聲波焊接和熱合焊接工藝形成的產品是“封閉式”的，防止有測漏或者破裂的部分導致無菌試驗被外來微生物污染從而造成假陽性的影響。

6．無菌性：市場上確實存在由于滅菌條件的不合理或者包裝的損壞造成的“非無菌的”無菌檢測套筒，因此高標準的滅菌工藝和高質量的包裝是合格的無菌檢測套筒的必要條件。

7．微生物恢復生長率試驗：根據濾膜的種類不同，主要是選擇環氧乙烷滅菌或者伽馬射線滅菌，但是這不是簡單地進行過度滅菌就達到的，因為環氧乙烷滅菌和伽馬射線滅菌都會有殘留，過度的滅菌會使得無菌檢驗套筒在進行無菌試驗時產生假陰性的結果。因此，合格的無菌檢測套筒會在進行無菌試驗的同時進行微生物的恢復生長試驗，以證明殘留的環氧乙烷或者放射性不會對微生物產生明顯的影響。

8．耐壓試驗：通常無菌試驗在進行時套筒內氣體的體積會被壓縮，因此在試驗過程中會積累較大的壓力，我們也應該考量套筒的耐壓性，是否這種套筒在試驗過程中較大的壓力下能夠保證原有的完整性并且不會發生爆裂等影響試驗的后果。以上試驗應該由使用者進行試驗證明或者由生產廠家的質量保證部門在進行過恰當的檢驗后出具文件證明。

無菌檢測培養基因素

應該考慮的可能影響實驗結果的因素還包括培養基和沖洗液?？梢允褂酶煞叟囵B基自行配制也可以使用成品培養基和沖洗液。這兩者的正確使用與否直接影響到實驗的結果。通常會做促生長試驗和無菌試驗來確認培養基、沖洗液的有效性和無菌性。進行無菌實驗室通常還會使用到一些添加劑，尤其是對于抑菌性比較強的樣品，會添加一些酶在培養基或者沖洗液中來抑制殘留的抗生素。所以，這些添加物也是需要保證有效性和無菌性的，當添加物加入到培養基和沖洗液中時，必須重新對培養基和沖洗液的有效性和無菌性重新進行測試。無菌性，促生長試驗結果，pH值和外觀通常是需要進行測試的項目。

培養基種類包括中國藥典（2010版）中的改良馬丁培養基和硫乙醇酸鹽培養基FTM，以及EP/USP/中國藥典（2015版）中的胰酪大豆胨液體培養基TSB（用于真菌和需氣菌的培養）和硫乙醇酸鹽培養基FTM（厭氧菌和需氣菌培養）。

對于FTM培養基，分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應符合培養結束后培養基氧化層（粉紅色）不超過培養基深度的1/2。在供試品接種前，培養基氧化層的高度不得超過培養基深度的1/5。

培養基適用性實驗的無菌性檢查：每批培養基隨機取不少于5支（瓶），置各培養基規定的溫度培養14天，應無菌生長。

靈敏度檢查：

取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養基7支，分別接種小于100CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養3天。

取每管裝量為9ml的胰酪大豆胨液體培養基7支,分別接種小于100CFU的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養5天。

空白對照不生長，接種菌液的培養基，應有明顯生長。

緩沖液的作用包括溶解、稀釋、潤濕濾膜、沖洗。緩沖液無菌性檢測的目的是確保沖洗液的無菌性；無菌檢查中避免由于實驗材料造成假陽性風險。

薄膜過濾方法：過濾之后培養觀察14天，沒有微生物生長（肉眼判斷培養基沒有渾濁），沖洗液被認為是無菌的；產品無菌檢查同步進行陰性對照。